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通过结构和生化分析新型糖苷水解酶134家族β-甘露聚糖酶与底物的结合机制

文章背景简介

半纤维素是由木糖,甘露糖,阿拉伯糖和半乳糖单元组成的多糖混合物。甘露聚糖分为线性甘露聚糖,葡甘露聚糖,半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。它们的主链由D-甘露糖残基或D-甘露糖和 D-葡萄糖残基配体通过β-1,4-糖苷键连接。半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖在甘露糖残基的C6位含有通过β-1,6-糖苷键连接的半乳糖侧链。甘露聚糖作为优良的膳食纤维,具有多种治疗效果和保健功能,

如减少饮食中脂肪的吸收和促进肠道益生菌的生长。此外,甘露聚糖可用作生物质进行乙醇发酵。

β-1,4-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是一种内切酶,广泛分布在低等动物,植物和微生物的胞外分泌物中。与外切酶不同,β-1,4-甘露聚糖酶随机水解甘露聚糖主链内的 β-1,4-糖苷键,产生甘露寡糖。根据其氨基酸序列,β-1,4-甘露聚糖酶在CAZy数据库中分为糖苷水解酶(GH)5、26、113和134家族。在GH 5、26和113家族中,所有β-甘露聚糖酶均具有典型的(β/α)8 TIM-桶蛋白折叠结构,并具有保留催化机制。近来,在构巢曲霉中发现了一种 β-甘露聚糖酶,通过进行性质研究将其归类为新的GH134家族。随后对来自链霉菌属的GH134家族β-甘露聚糖酶Ss GH134进行了结构解析,发现在其催化域中具有至少五个子位点的独特构型。Ss GH134显示出转化催化机理,与报道的其他β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶完全不同。迄今为止,仅有一个GH134家族成员的晶体结构被报道,但底物结合机制尚不明确。

中国农业大学工程学院北京高级食品营养与人类健康创新中心的尤鑫等人于2018年在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》(IF=4.021,生物2区)发表了题为Structural and biochemical insights into the substrate-binding mechanism of a novel glycoside hydrolase family 134 β-mannanase的文章。

所用到的主要方法

1、ITC检测动力学参数;

2、TLC检测寡糖水解特性;

3、悬滴气体扩散法进行结晶;

4、X射线衍射进行结构模拟;

5、定点诱变试剂盒法进行定点突变等。

文章主要内容摘要

半纤维素是来源于高等植物的可再生资源,甘露聚糖是其的主要成分之一。β-甘露聚糖酶是一种能够降解木质纤维素的酶。在本研究中,克隆并表达了来自小孢根霉的内切-β-甘露聚糖酶(RmMan134A)。重组RmMan134A的最适温度为50°C,最适pH为5.0 ,对刺槐豆胶比活性最高(2337 U / mg)。为了深入了解RmMan134A与底物结合的机制,进一步解析了四个复合的结构(RmMan134A–M3,RmMan134A-M4,RmMan134A-M5和Rm Man134A-M6)。这些结构表明,Rm Man134A的催化结构域中至少存在七个子位点(?3至+4)。-1位的甘露糖与His113和Tyr131通过氢键相结合,形成独特的构象。Lys48和Val159会形成与半乳糖侧链结合的空间位阻。此外,Rm Man134A–M5 的各种结合模式表明,在水解过程中,-2至+2的子位点是必不可少的。Rm Man134A–M4 的结构表明,甘露四糖结合+1至+4子位点,因此Rm Man134A无法水解聚合度 ≤4的甘露寡糖。通过合理的实验设计,显着提升了RmMan134A的比活力和最佳条件。本文旨在研究真菌 GH 134家族的β-1,4-甘露聚糖酶的结构和功能,以及GH134家族成员与底物结合机制。

本文主要研究结果:

(1)解析了真菌中GH134家族的β-1,4-甘露聚糖酶(Rm Man134A)的结构。

(2)研究了Rm Man134A对不同底物的催化效率。

(3)提出了GH134家族成员与底物的结合机制。

(4)在结构上解释了Rm Man134A 的底物特异性。


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